Nanofilm SEC

　　對(duì)于生物分離而言，生物分子與填料之間的非特異性相互作用往往會(huì)導(dǎo)致低的分離效率，如色譜峰拖尾以及低的回收率等。Nanofilm SEC填料所采用的獨(dú)特的表面化學(xué)技術(shù)可以在硅膠表面共價(jià)鍵合一層均勻的聚合物鏈。這種固定相具有中性和親水的性質(zhì)，因此可以最大限度消除填料基質(zhì)與生物分子，其中尤其是與蛋白之間的非特異性相互作用。這種經(jīng)過特別設(shè)計(jì)的涂層可以使Nanofilm SEC柱獲得高的分辨率和分離效率。例如，以尿嘧啶作為測(cè)試物可以獲得高達(dá)每米90,000的理論塔板數(shù)（見表1）。

　　賽分Nanofilm SEC柱高效分離的第一個(gè)例子見圖1。四種蛋白質(zhì)，甲狀腺球蛋白、BSA二聚體、BSA和溶菌酶，以及一種多肽在Nanofilm SEC柱上得到了滿意的分離。以溶菌酶計(jì)得到的理論塔板數(shù)高至30,000/m，因此溶菌酶中的一種雜質(zhì)都可以得到很好的分離，而這種分離效果通常只有在高效毛細(xì)管電泳中才看得到。SEC柱的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試樣品通常為Biorad 標(biāo)準(zhǔn)蛋白（甲狀腺球蛋白、免疫球蛋白G 、卵清蛋白、肌球素）。這些蛋白質(zhì)的pI均小于7.5，因此在pH=7.0時(shí)不會(huì)帶有明顯的正電荷。但是高度帶正電荷的蛋白質(zhì)，如溶菌酶（pI 11.0）、細(xì)胞色素（pI 10.6）、抑肽酶（pI 11.0）卻容易與填料表面的殘余硅羥基發(fā)生強(qiáng)靜電相互作用而非常難被洗脫。Nanofilm SEC柱不存在這個(gè)問題。而且，賽分公司建立了自己的蛋白測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)樣品，其中就包括了對(duì)生物分離性能非常敏感的溶菌酶。

圖1 在4.6mm I.D.×250mm Nanofilm SEC-150柱上分離4種蛋白和一個(gè)多肽。

從圖2可以看到，Nanofilm SEC-250柱（4.6mm I.D.×300mm），可以獲得牛血清白蛋白（BSA）和BSA雙聚體的分離，其中流動(dòng)相為150mM的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）。

　　甲狀腺球蛋白是一個(gè)大分子量蛋白（MW 670,000）。商品化的甲狀腺球蛋白含有聚合體雜質(zhì)，可能是雙聚體或四聚體。從圖3可以看到，Nanofilm SEC-500可以對(duì)甲狀腺球蛋白和甲狀腺球蛋白聚合體實(shí)現(xiàn)基線分離。

圖3 用Nanofilm SEC-500柱（5µm, 4.6mm I.D.×300mm）從甲狀腺球蛋白中分離出聚合體。

流動(dòng)相：150mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0

流速：0.35mL/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：UV 214nm

溫度：室溫（23°C）

進(jìn)樣體積：5µL

蛋白樣品：（1）聚合體；（2）甲狀腺球蛋白（1.0mg/mL），670kD

　　SEC填料孔徑的大小在蛋白分離中起到至關(guān)重要的作用。對(duì)于在某一特定分子量范圍內(nèi)分布的蛋白樣品而言，Nanofilm SEC固定相規(guī)格的選擇需要基于填料的排除極限和線性分子量范圍這兩個(gè)參數(shù)。

圖4 Nanofilm SEC-150、Nanofilm SEC-250和Nanofilm SEC-500柱（5µm, 7.8mm I.D.×300mm）分離效果的比較。

流動(dòng)相：150mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0

流速：0.25mL/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：UV 280nm

溫度：室溫（23°C）

進(jìn)樣體積：5µL

樣品：（1） 甲狀腺球蛋白（1.0mg/mL）， 670kD；（2）BSA （1.0mg/mL），66kD；（3）核糖核酸酶A（1.0mg/mL），13.7kD；（4） 尿嘧啶（2.5mg/mL），120 D

圖4為具有不同孔徑的Nanofilm SEC柱對(duì)分子量在120-670,000之間分布的三種蛋白的分離，從中可以看到Nanofilm SEC填料孔徑的不同對(duì)分離的影響。

　　Nanofilm SEC填料是在硅膠表面最大限度地共價(jià)鍵合一層親水的中性薄膜。蛋白或其它生物分子與這種填料的相互作用非常小。因此，蛋白在硅膠表面的吸附將會(huì)被抑制，這就保證了高的回收率，并可使蛋白在分離之后依然有著高的生物活性。表2是實(shí)驗(yàn)測(cè)得的酸性蛋白BSA和堿性蛋白溶菌酶的回收率數(shù)據(jù)。

　　Nanofilm SEC固定相具有致密的涂層鍵合密度，因此可阻止任意分子破壞硅膠與固定相之間的鍵合，從而保證填料具有高的穩(wěn)定性。Nanofilm SEC固定相可用于多種緩沖液中，如醋酸銨、磷酸鹽、Tris等。當(dāng)用150和100mM的磷酸緩沖液（pH7.0）作為流動(dòng)相時(shí)，在3個(gè)月或進(jìn)樣1000次后Nanofilm SEC柱的性能僅會(huì)發(fā)生輕微的改變，保留時(shí)間的偏差在5%以內(nèi)。圖5是Nanofilm SEC-150在1、5和10天，每天運(yùn)行10小時(shí)得到的結(jié)果。從圖中可以看到流出曲線基本重合。圖6是兩周內(nèi)蛋白和一個(gè)小分子在500倍柱體積內(nèi)保留時(shí)間的變化情況。從圖中可以看到保留時(shí)間變化的差異非常小。 Nanofilm SEC固定相可在高鹽濃度，如1.0M下使用。另外，Nanofilm SEC柱在有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、THF、DMF、DMSO等中，以及其與水的混和溶液中也相當(dāng)穩(wěn)定。 Nanofilm SEC柱在pH 2-8.5范圍內(nèi)穩(wěn)定。另外，在短時(shí)間內(nèi)也可以耐受高的pH，如pH 8.5-10。 Nanofilm SEC柱在溫度耐受方面表現(xiàn)突出。最高工作溫度可達(dá)到80°C。

圖5 Nanofilm SEC固定相穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

色譜柱：Nanofilm SEC-150（5µm, 4.6mm I.D.×300mm）

流動(dòng)相：150mM和100mM磷酸鹽緩沖液, pH 7.0

流速：0.35mL/min

溫度：室溫

進(jìn)樣體積：10µL

樣品：1. 甲狀腺球蛋白（1.0mg/mL）；2. BSA （1.0mg/mL）；3. 核糖核酸酶A（1.0mg/mL）；4. 尿嘧啶（50mg/mL）。每天運(yùn)行10小時(shí)

圖6 三種蛋白和尿嘧啶在500倍柱體積內(nèi)反復(fù)進(jìn)樣得到的保留時(shí)間的變化情況。測(cè)試條件同上圖。

　　對(duì)于SEC而言，填料孔徑的大小決定了所能分離的分子量范圍，而孔體積則決定了分離容量。Nanofilm填料擁有4種孔徑規(guī)格，可以覆蓋一個(gè)寬范圍分子量分布的生物大分子。圖7是Nanofilm SEC-150、Nanofilm SEC-250和Nanofilm SEC-500的蛋白分子量校正曲線。

圖7 Nanofilm SEC固定相穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

色譜柱：4.6mm I.D.´300mm, 填料粒徑為5µm

流動(dòng)相：150mM磷酸鹽緩沖液, pH 7.0

流速：0.25mL/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm

進(jìn)樣體積：5µL

樣品：1. 甲狀腺球狀蛋白（670kD）, 2. IgG（150kD）, 3. BSA雙聚體（132kD）, 4. BSA （66kD）, 5. 卵清蛋白（44kD）, 6. 肌紅蛋白（17.6kD）, 7. 溶菌酶（14.3kD）, 8. B12 （1.35kD）, 9. 尿嘧啶（120D）

另一種廣泛使用的表征SEC固定相的方法是以蛋白的分子量對(duì)擴(kuò)散系數(shù)（Kd）作圖。Kd按下式定義： Kd = （Ve-Vo）/（VT-Vo） 其中Ve、VT和Vo分別是樣品洗脫體積，色譜柱的總體積和柱的死體積。蛋白分子量和Kd的線性區(qū)間經(jīng)常會(huì)被作為SEC固定相選擇的參考。如圖8所示，Nanofilm SEC-150在一個(gè)寬的分子量范圍內(nèi)分子量和Kd之間有著良好的線性關(guān)系。

圖8 Nanofilm SEC-150的蛋白分子量校正曲線

色譜柱：Nanofilm SEC-150 （4.6mm I.D.×150mm, 5µm）

流動(dòng)相：100mM磷酸緩沖液，pH 7.0

流速：0.25mL/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：UV 214nm

溫度：室溫（23°C）

進(jìn)樣體積：5µL

樣品：（1） 甲狀腺球蛋白（670KD）；（2） IgG（150KD）；（3）BSA雙聚體（132KD）；（4 ）BSA（66KD）；（5）卵清蛋白（44KD）；（6）a-胰凝乳蛋白酶（25KD）；（7）肌紅蛋白（17.6kD）；（8）溶菌酶（14.3kD）；（9）多肽樣品（1.5kD）；（10）尿嘧啶（120D）

　　對(duì)于帶正電荷蛋白的分離，往往需要用高鹽濃度來減弱硅膠基質(zhì)與蛋白之間的強(qiáng)靜電相互作用。比如細(xì)胞色素C是一種富含正電荷的蛋白質(zhì)（pI=9.6），因此很難在低鹽濃度（比如50mM磷酸鹽緩沖液， pH 7.0）下被洗脫出來。使用高鹽濃度洗脫會(huì)限制SEC柱在蛋白分離中的應(yīng)用。賽分公司所開發(fā)的Nanofilm SEC柱可以有效地分離帶正電荷的蛋白質(zhì)。如圖9所示，采用Nanofilm SEC-500柱，細(xì)胞色素C可以在50mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中得到很好的分離，而這種分離效果是其它硅膠基質(zhì)SEC柱所無法實(shí)現(xiàn)的。Nanofilm SEC柱的出現(xiàn)為SEC開拓了許多新的應(yīng)用領(lǐng)域，例如分離對(duì)鹽敏感的生物分子，蛋白相互作用的研究，以及LC/MS檢測(cè)等。

圖9 細(xì)胞色素C在不同磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中的流出曲線

色譜柱：Nanofilm SEC-250柱（5µm, 4.6mm I.D.×300mm）

流速：0.35mL/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：UV 214nm

溫度：室溫（23°C）

進(jìn)樣體積：5µL

樣品濃度：1.0mg/mL

　　與Nanofilm SEC相比，SRT SEC具有更高的分離容量和分辨率，可供選擇的孔徑規(guī)格也要比前者多。但是，Nanofilm SEC在一些應(yīng)用，如使用低鹽濃度或含可揮發(fā)性鹽的有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相進(jìn)行富含正電荷生物分子的分離，多維色譜分離，以及LC/MS等中表現(xiàn)得更為穩(wěn)定，而這是傳統(tǒng)SEC固定相所無法實(shí)現(xiàn)的。另外，SRT和Nanofilm SEC固定相也具有不同的選擇性。SRT和Nanofilm SEC固定相可以組合起來使用，從而可為生物分子，水溶性聚合物，病毒和細(xì)菌，以及納米顆粒等的分離提供一個(gè)完整的分離方案。