引言
Introduction
單克隆抗體（mAb）的互補(bǔ)決定區(qū)（Complementarity-Determining Region，CDR）中氨基酸的氧化修飾會(huì)顯著影響抗體與抗原結(jié)合的能力以及生物學(xué)活性。在2020版中國(guó)藥典中，對(duì)mAb供試品氧化產(chǎn)物等雜質(zhì)進(jìn)行定量分析，是單抗制品檢定的重要指標(biāo)之一。近期，賽分科技客戶(hù)復(fù)宏漢霖于A(yíng)CS Pharmacol.Transl.Sci.上發(fā)表相關(guān)文章（*點(diǎn)擊底部左下角“閱讀原文”獲取文章鏈接）。文中介紹了一種基于疏水相互作用色譜（HIC）的方法，用于量化和表征CDR區(qū)域中的甲硫氨酸氧化變體（Met-Ox）。研究人員利用Proteomix HIC Butyl-NP5疏水分析柱及半制備柱，成功分離和富集目標(biāo)單抗的氧化變體。賽分科技HIC色譜柱在異質(zhì)體分離方面效果顯著，不僅適用于抗體的分析和穩(wěn)定性評(píng)估，而且對(duì)樣品制備和生物學(xué)功能研究提供重要支持。
背景介紹
IgG類(lèi)抗體是目前臨床治療中最常用的抗體類(lèi)型之一。對(duì)于IgG而言，氧化修飾作為質(zhì)量檢驗(yàn)的一個(gè)重要指標(biāo)，在評(píng)價(jià)抗體的穩(wěn)定性和功能性方面至關(guān)重要，特別是Met-Ox對(duì)抗體與抗原之間的親和力有著直接影響。在實(shí)際研發(fā)生產(chǎn)中，可采用半制備的方式來(lái)分離這些氧化變體，從而進(jìn)行進(jìn)一步的體外和體內(nèi)特性研究，以評(píng)估抗體性能。
當(dāng)前，測(cè)定Met-Ox通常采用C18或PS-DVB基質(zhì)的反相色譜柱進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)，但這種方法往往會(huì)導(dǎo)致抗體生物活性受損，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究人員選擇了賽分科技的Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色譜柱，可以有效分離目標(biāo)氧化變體，同時(shí)保證產(chǎn)品質(zhì)量和一致性。
文章概述
本研究通過(guò)對(duì)特定條件下不同時(shí)間點(diǎn)（從0.5 h至24 h）處理的目標(biāo)抗體mAb-A進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，考察了氧化處理后其分子量、亞單位構(gòu)象及生物活性的變化。研究發(fā)現(xiàn)，隨著氧化時(shí)間的增長(zhǎng)，mAb-A的分子量逐漸增加，這主要是由于重鏈（HC）上的Met105位點(diǎn)發(fā)生了二硫鍵斷裂導(dǎo)致的氧化反應(yīng)。此外，F(xiàn)(ab')2片段內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)對(duì)稱(chēng)位置的氧化敏感位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的氧化使得HIC圖譜出現(xiàn)了多個(gè)不同的峰組（PG），證實(shí)了Met105為主要的氧化位點(diǎn)。進(jìn)一步研究表明，雖然Met105位點(diǎn)的氧化并不影響抗原結(jié)合能力，但它明顯降低了mAb-A對(duì)PD-1/PD-L1通路的阻斷活性。
氧化變體分析
Column:
Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 4.6 × 250 mm)
Mobile Phase:
A: 2 M sodium sulfate in tris-base at pH 7.0
B: tris-base at pH 7.0.
Flow Rate: 0.5 mL/min
Temp: 30 °C
Detection: 280 nm
Sample Amount: 30 μg
圖1. mAb-A樣品分析色譜圖
作為mAb-A的參考藥物（RMP），Keytruda在CDR區(qū)域含有氧化變異體。為了確保mAb-A的質(zhì)量和與RMP相似性，研究人員建立HIC方法對(duì)樣品進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖1所示。圖1中，主峰組（MPG）在大約22 - 27 min，峰前組1（PG1）在大約20 - 22 min洗脫。與MPG相比，PG1的洗脫時(shí)間更早。
圖2. mAb-A及其氧化變體分析色譜圖（0.25%的tBHP在0，0.5，4和24h）
為了確認(rèn)氧化變異體的存在，研究人員在氧化條件下對(duì)mAb-A進(jìn)行了強(qiáng)制降解，隨后使用HIC方法進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖2所示。與對(duì)照樣品相比，隨著氧化程度的增加，MPG逐漸轉(zhuǎn)化為PG1，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為PG2。圖中所示，在氧化0.5 h后，樣品的MPG百分比降低，PG1升高，并觀(guān)察到一個(gè)新的峰組PG2。在氧化4 h的樣品中，MPG的下降和PG1和PG2的增加更為明顯。在氧化24 h后，MPG和PG1的峰幾乎消失不見(jiàn)，而PG2的峰面積占比達(dá)到94%。
表1. LC-MS/MS Trypsin PTM與HIC色譜法結(jié)果百分比對(duì)比
表1列舉了LC-MS/MS Trypsin PTM結(jié)果和從分析HIC色譜法計(jì)算出的百分比。兩種方法得出的結(jié)果非常接近，表明HIC色譜分析法可以作為一種快速篩查的有效替代方法。
制備收集
Column:
Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 10 × 250 mm)
Mobile Phase:
A: 2 M sodium sulfate in tris-base at pH 7.0
B: tris-base at pH 7.0.
Flow Rate: 2.0 mL/min
Temp: 30 °C
Detection: 280 nm
Sample Amount: 2 mg.
圖3.mAb-A氧化變體HIC分析色譜圖（0.25%的tBHP氧化4 h）
圖3-a.mAb-A氧化變體分級(jí)收集
圖3-b.mAb-A氧化變體純度檢測(cè)
圖3是對(duì)氧化4 h的mAb-A進(jìn)行分級(jí)收集及純度檢測(cè)的結(jié)果。其中圖3-a是HIC組分收集示意圖。圖3-b表示將富集的樣品超濾三次，然后進(jìn)行HIC分析來(lái)確定各組分的純度。各組分的分析圖譜與制備圖譜對(duì)比，可以看出半制備規(guī)格Proteomix HIC Butyl-NP5色譜柱保持高分辨率，制備的樣品保持高純度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
綜上所述，研究人員使用賽分科技的Proteomix HIC Butyl-NP5分析與制備柱，成功地對(duì)目標(biāo)抗體mAb-A的氧化變體進(jìn)行了分離和富集，制備后的樣品可保持生物學(xué)活性，可用于后續(xù)研究。此方法不僅適用于監(jiān)測(cè)mAb的氧化穩(wěn)定性，而且在其他mAb的探索性研究和開(kāi)發(fā)過(guò)程中也具有廣泛的應(yīng)用前景。
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