引言
日常的液相實(shí)驗(yàn)操作中，流動相配制是實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員需要掌握的基礎(chǔ)。流動相的選擇和配制不僅影響樣品的溶解度和分離效果，還直接關(guān)系到色譜柱的壽命和儀器的使用性能。因此，掌握流動相的配制技巧對于獲得準(zhǔn)確的色譜分析結(jié)果至關(guān)重要。
本期我們以體積排阻色譜（Size-Exclusion Chromatography，SEC）為例，與大家分享一些流動相配制方面的技巧小貼士，幫助大家獲得穩(wěn)定可靠的分析結(jié)果。
流動相選擇
生物大分子的SEC方法，最常用的流動相是磷酸緩沖鹽。通常情況下，SEC的分離效果不受流動相的影響。若峰形受到靜電吸附作用及疏水作用的影響，造成拖尾或出峰異常等現(xiàn)象，則可以在流動相中加入高鹽或有機(jī)試劑來進(jìn)行改善。常用的有機(jī)試劑包括：異丙醇、乙腈等。
選擇要點(diǎn)
1.樣品在選用的流動相中有較好的溶解性和穩(wěn)定性；
2.流動相需在色譜柱的耐受范圍內(nèi)使用，包括流動相的pH、有機(jī)相比例等。通常硅膠基質(zhì)的SEC色譜柱，耐受流動相的pH范圍為2.0~8.0，如需在緩沖鹽中加入有機(jī)試劑，有機(jī)試劑的添加比例需控制在20%以內(nèi)。
配制步驟
1.150mM PB緩沖鹽：
稱取Na?HPO?·12H?O 62.01g和NaH?PO?·2H?O 19.795g置于2L燒杯中，加入2000mL超純水。用磷酸或氫氧化鈉溶液微調(diào)至pH7.0，抽濾。
2.150mM PB緩沖鹽+5%異丙醇（體積比）：
按上述方法配制150mM PB緩沖鹽（pH7.0）950mL，加入50mL異丙醇，超聲15min。混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。
3.20mM PB緩沖鹽+250mM NaCl：
稱取NaH?PO?·2H?O 1.59g和Na?HPO?·12H?O 3.51g以及NaCl 14.61g ，加入1000mL超純水，微調(diào)至pH7.0，抽濾 。
4.如需其他pH磷酸鹽緩沖液，可以參考以下配比表，根據(jù)實(shí)際需求進(jìn)行配制。
表1.不同pH的磷酸鹽緩沖液配制表
*A液：0.2M NaH?PO?水溶液；B液：0.2M Na?HPO?水溶液
注意事項(xiàng)
1.當(dāng)系統(tǒng)內(nèi)原為緩沖鹽溶液需替換為高有機(jī)相比例（純）溶劑或系統(tǒng)內(nèi)原為高有機(jī)相比例（純）溶劑需替換為緩沖鹽溶液時，必須先用純水或低有機(jī)相比例溶劑（如小于20%有機(jī)相）過渡。過渡時，通常設(shè)定流速為實(shí)驗(yàn)流速的一半，沖洗2倍柱體積。
2.流動相最好現(xiàn)配現(xiàn)用：乙腈揮發(fā)快，易導(dǎo)致有機(jī)相比例變化；磷酸鹽緩沖液易長霉長菌。
3.流動相一般貯存在玻璃、聚四氟乙烯容器中，不能用塑料容器貯存。
4 緩沖鹽流動相連續(xù)使用一般不超過兩天。
實(shí)驗(yàn)要領(lǐng)
1.過濾和脫氣：
將配制好的無機(jī)鹽緩沖液通過0.45μm或更小孔徑水系濾膜進(jìn)行過濾，以去除其中的不溶性顆粒。同時，使用超聲波或真空脫氣機(jī)對流動相進(jìn)行脫氣，以消除其中的氣泡，確保色譜分析的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。
2.調(diào)整pH：
合適的pH值有助于改善樣品的溶解性和分離效果。通常SEC色譜柱流動相需要保持在pH7.0中。
3.色譜柱保存：
若長期不用時，SEC色譜柱建議保存在含0.02%NaN3的150mM磷酸鈉緩沖液（pH7.0）或20%乙醇中，以防止菌體污染。
產(chǎn)品介紹
在建立SEC方法時，需根據(jù)樣品分子量大小、尺寸大小等信息，選擇合適孔徑的色譜柱，此外要根據(jù)分離目的，選擇合適的粒徑和填料工藝。賽分科技SEC系列色譜柱，采用特有的表面修飾技術(shù)，分離速度快，分辨率高，是分析型SEC值得信賴的產(chǎn)品。
圖1.賽分科技SEC固定相表面修飾工藝
“-C”系列產(chǎn)品，采用賽分科技獨(dú)有的固定相修飾工藝，硅膠表面鍵合一層“平躺”的單分子層，最大程度減少非特異性相互作用。適用于疏水性較強(qiáng)的樣品，可以減少有機(jī)相的使用，“-C”系列產(chǎn)品安全、環(huán)保，讓您的實(shí)驗(yàn)無后顧之憂。
賽分科技SEC系列色譜柱，分離范圍廣，適用于多種細(xì)分領(lǐng)域，下表是部分產(chǎn)品的分離范圍。
表2.賽分科技SEC色譜柱分離范圍
